João III
o Piedoso
João III heredó el Imperio global que su padre Manuel había construido y se enfrentó a la tarea de administrar y sostener una presencia dispersa desde Brasil hasta Macao. El reinado de treinta y seis años estuvo marcado por la tensión entre el coste creciente del mantenimiento del Imperio y los recursos disponibles de un reino cuya población era relativamente pequeña para la escala de las empresas que sostenía.
La introducción de la Inquisición en Portugal en 1536 fue la decisión de mayor impacto duradero de su reinado. El tribunal inquisitorial, establecido con autorización papal pero bajo control de la Corona, se concentró principalmente en la persecución de los cristãos-novos —judíos que se habían convertido al cristianismo en 1496-1497—, a los que se sospechaba de practicar el judaísmo en secreto. La Inquisición portuguesa operó durante casi tres siglos y dejó una huella profunda en la estructura social e intelectual del reino.
En Brasil, João organizó la colonización sistemática con las capitanías hereditarias de 1534 y el primer gobierno general establecido en 1549, dando una estructura administrativa a un territorio que hasta entonces había tenido una presencia portuguesa esporádica. La llegada de los jesuitas, invitados por él en 1540, definió el perfil de la evangelización y la educación colonial. Murió en 1557 sin haber designado un sucesor adulto: le sucedió su nieto Sebastião, de tres años.